Rôle des thiorédoxine réductases TrxR1 et TrxR2 dans la pathogénèse des infections à Scedosporium apiospermum

Porteur du projet : Nicolas PAPON

CHU d'Angers, Unité de Recherche "Infections Respiratoires Fongiques"

Contexte :
Les poumons des patients atteints de mucoviscidose sont fréquemment colonisés par des microorganismes qui peuvent provoquer des infections respiratoires. Les bactéries et spores fongiques inhalées sont piégées dans le mucus où elles trouvent un environnement favorable à leur développement. Scedosporium apiospermum est un champignon filamenteux qui colonise fréquemment les voies respiratoires. En raison de sa capacité à disséminer en l'absence de défenses immunitaires et de sa faible sensibilité aux antifongiques actuels, la colonisation des voies respiratoires par ce champignon compromet souvent les chances de succès d'une transplantation pulmonaire. Il est donc nécessaire d'améliorer le dépistage de ce champignon, mais aussi de découvrir de nouveaux traitements plus efficaces, ce qui nécessite une meilleure connaissance des mécanismes à l’origine du pouvoir pathogène de ce champignon.

Objectifs :
Notre projet vise à caractériser deux gènes de Scedosporium apiospermum qui produisent deux enzymes appelées thiorédoxine réductases (TrxR1 et TrxR2), potentiellement impliquées dans la capacité du champignon à échapper à la réponse immune. Plus précisément, nous tenterons de démontrer en utilisant diverses technologies que TrxR1 et TrxR2 sont utilisées par Scedosporium apiospermum pour contrer les attaques du système immunitaire auxquelles il doit faire face lorsqu’il infecte les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose. En supprimant, grâce à nos outils génétiques, la capacité de Scedosporium apiospermum à produire les thiorédoxine réductases TrxR1 et TrxR2, nous essayerons de démontrer que l’absence de ces deux enzymes rend le champignon inoffensif. L’ensemble de ces expériences permettra donc de montrer que les thiorédoxine réductases TrxR1 et TrxR2 sont indispensables à Scedosporium apiospermum pour coloniser les voies respiratoires et engendrer une infection.

Perspectives :
D’ici la fin de cette première année de thèse, nous vérifierons par Southern-Blot l’absence d’intégration ectopique des cassettes d’invalidation, et étudierons les répercussions phénotypiques de l’invalidation de TRXR1 ou TRXR2. Les mutants seront comparés à leur souche parentale et microscopie électronique à transmission pour vérifier l’absence d’impact sur l’ultrastructure de la paroi. La croissance sera évaluée à différentes températures ou en présence d’agents de stress pariétal pour vérifier l’absence d’impact sur la tolérance à ces différents stress.
L’impact de l’invalidation génique sur la protection du champignon vis-à-vis du stress oxydant sera évalué par étude de la cinétique de croissance des mutants et de leur parent par Laser néphélométrie en présence de générateurs du stress oxydant, et pour la sensibilité au peroxyde d’hydrogène par diffusion en gélose. Parallèlement, nous évaluerons par cytométrie en flux l’ingestion des spores des doubles mutants ou de leur parent par des macrophages M1, ainsi que leur devenir dans les macrophages.
Enfin, la virulence des doubles mutants et de leur parent sera évaluée dans un modèle expérimental de scédosporiose disséminée sur souris immunocompétentes.

Résultats obtenus :
Afin d’invalider les gènes TRXR codant les deux thioredoxine réductases présentes chez S. apiospermum, nous avons analysé les séquences nucléotidiques de ces gènes et de leur environnement afin d’identifier les outils nécessaires à la réalisation de la technique CRISPR-Cas9.
Au terme de ces six mois de thèse, nous avons donc identifié des protospacers pour les gènes TRXR1, TRXR2, NRPS 1828 et NRPS 10275, et les crRNA correspondants ont été synthétisés. Les complexes RNP les plus efficaces pour exciser les gènes d’intérêt ont été sélectionnés. Une cassette d’invalidation a été produite pour chacun des deux gènes TRXR, et trois expériences de transformation ont été conduites.
Nous disposons à ce jour de 22 transformants validés en PCR pour le gène TRXR2 et de 13 validés en PCR pour TRXR1.